免疫組化中的雙染色技巧
來源：
衡道病理 HISTO PATH
發布時間：2020-07-27
免疫組織化學（Immuohistochemistry，IHC）為探討組織或細胞內蛋白常見的方法，利用抗體與抗原結合找到所需要的蛋白座落的地方，然而為了可以在同一個組織或細胞找到兩個標的蛋白表現或結構（圖一），或者是在同一組織中觀察不同的細胞型態，雙染的技術（Double stain）相對重要，不但可以節省樣本數量與準備時間，也可有效節省經費之花費。
雙染色為可以在同一個樣本中進行兩個抗原的定位與檢測，跟熒光方式最大的不同為不需要結合（合并）圖片，肉眼即可發現兩個蛋白顏色之不同，且可以永久保存，不用擔心信號降解之問題。
雙染跟傳統的組織染色流程相似，利用一樣的顯色方式與試劑，但其實要在同一個樣本中，呈現兩個不同顏色蛋白其實沒那么容易，其中的阻斷劑（blocking buffer），顯色劑（substrate），抗體等試劑可都是有很高深的學問在里面的，例如AP呈現系統中，含有磷酸根的試劑都必須避免，減少信號之干擾。
圖一：右圖為人類視網膜內皮細胞免疫組織染色，左圖為人類扁桃腺免疫染色。
Blocking
雙染時必須特別注意封閉的步驟，避免非專一性的結合信號干擾，尤其是二級抗體（二抗）要辨認一級抗體（一抗）的步驟，常會發生有雜訊干擾的現象發生，因此封閉的步驟更顯得重要。除此之外，封閉也是降低背景值的關鍵。高背景值常為IHC會遇到的問題，其干擾的信號來源主要為組織內源性酵素（endogenous enzymes）或是抗體Fc端的非專一性結合所導致。
在雙染的實驗下，可以選擇不同的顯色系統，但常見的還是選擇同一個顯色系統，只需要選不同色即可。但也因為都是同一的系統，因此適合的Blocking buffer與專一性高的抗體為重要之課題，根據不同的需求選擇合適的blocking更為重要。
Blocking/Inactivating Enzymes
內源性的過氧化酶 (peroxidases) 與磷酸酶 (phosphatases) 與顯色劑 (substrate) 結合為導致高背景的主因，有效抑制過氧化酶與磷酸酶活性可達到降低背景值之要求。
不同顯色系統選擇的顯色劑也不同，levamisole分子可有效抑制磷酸酶活性。然而在腸道組織中的磷酸酶則不受到levamisole抑制，不過有些廠商的廣譜性產品即使遇到對于levamisole 有拮抗性的磷酸酶，還是能夠有效抑制其活性。
另一些產品可有效抑制內源性的過氧化酶。有些實驗會建議使用過氧化氫 (H2O2) 來阻隔內源性的HRP作用，但最常面臨到的問題是實驗過程中產生的氣泡破壞原組織結構，即使將 H2O2 溶在甲醇中可以改善氣泡的產生，但卻易導致抗原被破壞，導致單株抗體無法辨認結合，種種因素導致現在越來越多研究者選擇商品化的blocking buffer。
在雙染IHC 的實驗中，因為會使用兩只 HRP 標定的抗體，在加第二只 HRP 標定抗體前，必須確認第一只 HRP 抗體的酵素活性失活，避免殘留的 HRP 活性影響到后續的信號，此時尤其需要在不傷害抗原結構的前提下使第一支抗體上的 HRP 失活。
Blocking General Nonspecific Binding
通常為了增加組織貼附性，玻片上會經過一些表面處理，像是Poly-D-Lysine處理，然而這樣的處理雖然可以增加貼附，但是在沒有組織的區域也容易導致非專一性蛋白結合，此外抗體也可能會和組織形成非專一性結合影響到后續的判讀。
在免疫細胞中的FCγ受體也有可能會造成高背景的現象，主要是因為FCγreceptor對于IgG結合力都不相同，然而高親和性與低親和性IgG結合力所使用的封閉方式也有所不同。如果組織中為低親和性的FCγ受體就比較不用擔心，只要增加清洗試劑培養的時間即可破壞其鍵結；但如果是高親合性的FCγ受體即較為棘手，因為對于IgG的結合力比較強，因此只靠清洗試劑無法將非專一性的結合去除，血清或是未標記的IgG可以有效減少專一性的結合。10％BSA稀釋劑/封閉液（＃50-61-00）或是10％血清最常被拿來使用抑制非專一結合；少量的洗滌劑存在，例如0.05％Tween 20溶在阻塞緩沖區或是清洗試劑也可以改善非專一性結合的問題。
Choice of Antibodies
免疫染色一直都是研究的潮流，陸續都有許多抗體公司研發IHC專用抗體去迎合市場，除了一級抗體外，辨認一級抗體的二級抗體更是關鍵，大都是多株抗體，最大的好處為可以增加信號，但多株抗體最常遇到的問題為不同物種間的交叉反應（cross-reactivities），因此即使是二抗，最好也要通過不同物種間的血清吸附反應，減少交叉反應的發生。
有的大廠為了嚴格管控二抗的品質，會經過10道純化手續步驟（圖二），包含正篩選IgG外，會再通過負篩選，將構型相似的IgM或IgA去除后，再進行后續的過濾包裝，這樣繁雜的手續可以讓背景值降到最低，且專一性與稀釋倍數高，更有些抗體會通過血清吸附之實驗，減少物種交叉反應之發生。反之如果只經過3-4道純化手續的粗糙手法，容易有雜訊的產生，往往會影響后續的實驗。
圖二
Biotinylated Antibodies
如果兩只一級抗體皆來于同一物種時，沒有辦法利用二級抗體去做雙染的實驗，主要原因是二抗為辨認一抗之物種，如果一級抗體的物種相同時則無法分辨為哪一只抗體之信號，因此如果實驗遇到這樣的狀況，則會建議在其中一只一級抗體后方接上生物素（Biotin），這樣就可以利用Biotin會與鏈霉親和素（streptavidin）結合的特性去區分，所以其中一只的二級抗體為要選擇Streptavidin接上HRP或是AP酵素即可做后續顯色的實驗。如果是這樣的做法的話，未標定的一抗要先檢測，之后再阻止掉非專一性的結合，后續再加入另外一只有標定biotin的一級抗體即可。
當然除了Biotin- streptavidin的方式，也有其他替代方案，例如選擇FITC標定一級抗體，那二抗選擇anti-FITC即可。
HRP與AP為IHC中最常被使用的酵素，AP系統的好處為可以較長時間表現信號，但過度冗長的顯色也會導致高背景值的發生，通常不建議超過10-20分鐘。雙染的實驗中，也可以搭配其它合適的產品抑制內源性的HRP酵素活性，可以增加約兩倍的信號值但不會增加背景值。
Whole Antibody vs. Fab vs. F(ab’)2
市面上的抗體除了有全IgG，也有不同的同種型，像是Fab或是F（ab'）2，兩者的差異在于中間是否有雙硫鍵的結合。如果樣本是淋巴系統或是其他免疫系統的話，因為要考慮Fc receptor的問題，F（ab'）2與Fab為不錯的選擇，且他們的分子小，也比較容易滲透入福馬林固定的組織中。但因為他們制造過程較繁復，所以抗體的價格會較高。
Choice of Substrates
為了能夠分辨出不同的目標蛋白，要避免相同色系或是吸收光譜。HRP系統常見的基板為DAB，為棕色沉淀，其產物非常穩定，適合做雙染的選擇。AP系統不如HRP系統普及。
Counterstains
Counterstains為染細胞核的染劑，目的是確認細胞位置，為染背景值的方式，在選擇上只要顏色沒有跟其他顯色劑重復即可。當然此染色取決于實驗需求，并非必須的程序。
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