免疫組化中的雙染色技巧
來源:
衡道病理 HISTO PATH
發布時間:2020-07-27
免疫組織化學(Immuohistochemistry,IHC)為探討組織或細胞內蛋白常見的方法,利用抗體與抗原結合找到所需要的蛋白座落的地方,然而為了可以在同一個組織或細胞找到兩個標的蛋白表現或結構(圖一),或者是在同一組織中觀察不同的細胞型態,雙染的技術(Double stain)相對重要,不但可以節省樣本數量與準備時間,也可有效節省經費之花費。
雙染色為可以在同一個樣本中進行兩個抗原的定位與檢測,跟熒光方式最大的不同為不需要結合(合并)圖片,肉眼即可發現兩個蛋白顏色之不同,且可以永久保存,不用擔心信號降解之問題。
雙染跟傳統的組織染色流程相似,利用一樣的顯色方式與試劑,但其實要在同一個樣本中,呈現兩個不同顏色蛋白其實沒那么容易,其中的阻斷劑(blocking buffer),顯色劑(substrate),抗體等試劑可都是有很高深的學問在里面的,例如AP呈現系統中,含有磷酸根的試劑都必須避免,減少信號之干擾。

圖一:右圖為人類視網膜內皮細胞免疫組織染色,左圖為人類扁桃腺免疫染色。
Blocking
雙染時必須特別注意封閉的步驟,避免非專一性的結合信號干擾,尤其是二級抗體(二抗)要辨認一級抗體(一抗)的步驟,常會發生有雜訊干擾的現象發生,因此封閉的步驟更顯得重要。除此之外,封閉也是降低背景值的關鍵。高背景值常為IHC會遇到的問題,其干擾的信號來源主要為組織內源性酵素(endogenous enzymes)或是抗體Fc端的非專一性結合所導致。
在雙染的實驗下,可以選擇不同的顯色系統,但常見的還是選擇同一個顯色系統,只需要選不同色即可。但也因為都是同一的系統,因此適合的Blocking buffer與專一性高的抗體為重要之課題,根據不同的需求選擇合適的blocking更為重要。
Blocking/Inactivating Enzymes
內源性的過氧化酶 (peroxidases) 與磷酸酶 (phosphatases) 與顯色劑 (substrate) 結合為導致高背景的主因,有效抑制過氧化酶與磷酸酶活性可達到降低背景值之要求。
不同顯色系統選擇的顯色劑也不同,levamisole分子可有效抑制磷酸酶活性。然而在腸道組織中的磷酸酶則不受到levamisole抑制,不過有些廠商的廣譜性產品即使遇到對于levamisole 有拮抗性的磷酸酶,還是能夠有效抑制其活性。
另一些產品可有效抑制內源性的過氧化酶。有些實驗會建議使用過氧化氫 (H2O2) 來阻隔內源性的HRP作用,但最常面臨到的問題是實驗過程中產生的氣泡破壞原組織結構,即使將 H2O2 溶在甲醇中可以改善氣泡的產生,但卻易導致抗原被破壞,導致單株抗體無法辨認結合,種種因素導致現在越來越多研究者選擇商品化的blocking buffer。
在雙染IHC 的實驗中,因為會使用兩只 HRP 標定的抗體,在加第二只 HRP 標定抗體前,必須確認第一只 HRP 抗體的酵素活性失活,避免殘留的 HRP 活性影響到后續的信號,此時尤其需要在不傷害抗原結構的前提下使第一支抗體上的 HRP 失活。
Blocking General Nonspecific Binding
通常為了增加組織貼附性,玻片上會經過一些表面處理,像是Poly-D-Lysine處理,然而這樣的處理雖然可以增加貼附,但是在沒有組織的區域也容易導致非專一性蛋白結合,此外抗體也可能會和組織形成非專一性結合影響到后續的判讀。
在免疫細胞中的FCγ受體也有可能會造成高背景的現象,主要是因為FCγreceptor對于IgG結合力都不相同,然而高親和性與低親和性IgG結合力所使用的封閉方式也有所不同。如果組織中為低親和性的FCγ受體就比較不用擔心,只要增加清洗試劑培養的時間即可破壞其鍵結;但如果是高親合性的FCγ受體即較為棘手,因為對于IgG的結合力比較強,因此只靠清洗試劑無法將非專一性的結合去除,血清或是未標記的IgG可以有效減少專一性的結合。10%BSA稀釋劑/封閉液(#50-61-00)或是10%血清最常被拿來使用抑制非專一結合;少量的洗滌劑存在,例如0.05%Tween 20溶在阻塞緩沖區或是清洗試劑也可以改善非專一性結合的問題。
Choice of Antibodies
免疫染色一直都是研究的潮流,陸續都有許多抗體公司研發IHC專用抗體去迎合市場,除了一級抗體外,辨認一級抗體的二級抗體更是關鍵,大都是多株抗體,最大的好處為可以增加信號,但多株抗體最常遇到的問題為不同物種間的交叉反應(cross-reactivities),因此即使是二抗,最好也要通過不同物種間的血清吸附反應,減少交叉反應的發生。
有的大廠為了嚴格管控二抗的品質,會經過10道純化手續步驟(圖二),包含正篩選IgG外,會再通過負篩選,將構型相似的IgM或IgA去除后,再進行后續的過濾包裝,這樣繁雜的手續可以讓背景值降到最低,且專一性與稀釋倍數高,更有些抗體會通過血清吸附之實驗,減少物種交叉反應之發生。反之如果只經過3-4道純化手續的粗糙手法,容易有雜訊的產生,往往會影響后續的實驗。

圖二
Biotinylated Antibodies
如果兩只一級抗體皆來于同一物種時,沒有辦法利用二級抗體去做雙染的實驗,主要原因是二抗為辨認一抗之物種,如果一級抗體的物種相同時則無法分辨為哪一只抗體之信號,因此如果實驗遇到這樣的狀況,則會建議在其中一只一級抗體后方接上生物素(Biotin),這樣就可以利用Biotin會與鏈霉親和素(streptavidin)結合的特性去區分,所以其中一只的二級抗體為要選擇Streptavidin接上HRP或是AP酵素即可做后續顯色的實驗。如果是這樣的做法的話,未標定的一抗要先檢測,之后再阻止掉非專一性的結合,后續再加入另外一只有標定biotin的一級抗體即可。
當然除了Biotin- streptavidin的方式,也有其他替代方案,例如選擇FITC標定一級抗體,那二抗選擇anti-FITC即可。
HRP與AP為IHC中最常被使用的酵素,AP系統的好處為可以較長時間表現信號,但過度冗長的顯色也會導致高背景值的發生,通常不建議超過10-20分鐘。雙染的實驗中,也可以搭配其它合適的產品抑制內源性的HRP酵素活性,可以增加約兩倍的信號值但不會增加背景值。
Whole Antibody vs. Fab vs. F(ab’)2
市面上的抗體除了有全IgG,也有不同的同種型,像是Fab或是F(ab')2,兩者的差異在于中間是否有雙硫鍵的結合。如果樣本是淋巴系統或是其他免疫系統的話,因為要考慮Fc receptor的問題,F(ab')2與Fab為不錯的選擇,且他們的分子小,也比較容易滲透入福馬林固定的組織中。但因為他們制造過程較繁復,所以抗體的價格會較高。
Choice of Substrates
為了能夠分辨出不同的目標蛋白,要避免相同色系或是吸收光譜。HRP系統常見的基板為DAB,為棕色沉淀,其產物非常穩定,適合做雙染的選擇。AP系統不如HRP系統普及。
Counterstains
Counterstains為染細胞核的染劑,目的是確認細胞位置,為染背景值的方式,在選擇上只要顏色沒有跟其他顯色劑重復即可。當然此染色取決于實驗需求,并非必須的程序。
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