免疫吸附色譜技術的發展及其在神經科學中的應用
來源：
91360智慧病理網
發布時間：2020-11-13
1、背景
熒光顯微光學切片斷層成像系統（f-MOST）是一種研究腦神經網絡連接的新方法，要對特定的腦組織進行成像，首先要求神經元胞體和纖維被熒光物質標記，如熒光蛋白，為了獲得細節更加豐富的神經元連接信息，我們需要對熒光蛋白的熒光信號進行放大，比較常用的信號放大方法是免疫組織化學熒光染色法，其依據的原理是，一個熒光蛋白分子可以和多個帶有熒光基團的抗體特異性結合，從而實現熒光蛋白熒光信號的放大，與此同時，對于腦組織內的非熒光內源性物質，要想實現對它們的熒光顯微光學成像，也可以通過免疫組織化學的方法進行標記。
對于大體積生物組織，要想實現對于組織中內源性物質的均勻抗體標記，首先需要抗體均勻擴散到生物組織，但由于熒光抗體通常會先和組織外圍的抗原結合，并形成一道屏障，阻擋外部的熒光抗體進一步擴散進入生物組織內部。如果能夠實現抗原-抗體結合反應的可逆性控制，那么就可以保證抗體在進入組織的時候不發生反應，均勻擴散進入生物組織之后再發生反應，這樣一來就實現了抗原的均勻性標記，而免疫吸附色譜法正是研究抗原抗體結合反應可逆性控制的一門科學，研究免疫吸附色譜對于實現大體積生物組織免疫組織化學熒光染色具有重要意義。
免疫親和色譜法(Immunoaffinity Chromatography，IAC)主要是利用抗原抗體反應有選擇性從復雜環境基體中提取待測物，將抗體共價鍵合到不溶性的固態聚合物上，填充到色譜柱中，由于抗體抗原的可逆性結合，后者被持留，通過改變pH值、離子強度或離液序列高的試劑(Chaotropic agents)及有機溶劑釋放出抗原。
通常情況下，抗原-抗體的結合發生在中性或者略高于中性的磷酸鹽緩沖液或含有氯化鈉的硼酸鹽緩沖液中，也可能是在非離子型表面活性劑中。固定化的單克隆抗體，就像任何蛋白質一樣，在其表面上具有帶電基團，并傾向于作為混合離子交換劑，以便在緩沖液中的鹽的存在下，將減少離子相互作用。使用洗滌劑并不總是合適的，特別是對潛在的治療產品，由于從蛋白質中清除洗滌劑很困難。
2、技術簡介
從吸附劑洗脫抗原被稱為IAC的“黑色藝術”。洗脫策略一般可分為：
?。?）改變體系pH
?。?）使用離液序列高的鹽
?。?）改變離子強度
?。?）使用變性試劑
?。?）使用有機試劑
?。?）改變物理條件，如溫度、壓力、電場強度
洗脫劑的目的是建立導致其抗原的抗體的親和力降低的條件，使抗原返回到溶液中，并可以在洗脫液中被收集。關鍵在于在實現上述功能的同時保留抗原和抗體的活性。
改變pH是洗脫抗原最常見的方法，更加常見的是用甘氨酸緩沖液、乙酸或丙酸將pH調至酸性范圍，因為鼠源的單克隆抗體即便是被固定之后在堿性pH條件下也是不穩定的。丙酸對于增加洗脫液極性來講具有顯著效果，這可能有助于分解疏水力發揮的一部分而穩定的抗原抗體復合物。高pH也有使用，一般通過氨水、碳酸鹽或胺類如乙醇胺來實現。
離液離子通過影響水的結構和減少疏水相互作用來施加影響，這些用于IAC洗脫的離子按照離液序列增加的順序排列如下：
Cl-< I- < ClO4- < CF3COO- < SCN- < CCl3COO-
在中性緩沖液這濃度達到3M的硫氰酸鹽和碘化物是最常用的離液離子。
增加溶劑的離子強度是一個溫和的洗脫條件，但使用氯化鈉的時候它很難有效。常用的二價離子鹽陽離子有鎂離子和鈣離子。4.5M的MgCl2的離子強度是13.5M，并且氯離子濃度是9M。這可能在一定程度上解釋這種同時具有高濃度和低離液序列的溶液可以破壞離子相互作用，另外鈣離子和鎂離子的離液序列比鈉離子和鉀離子要高。
在IAC中最常見的變性試劑是6-8M的尿素和3-4M的鹽酸胍，這種變性試劑最好不要用，除非它可以協助吸附劑的清洗。
有機溶劑在某些情況下備受青睞，乙二醇除外，因為它很少用于IAC，在可用于抗原洗脫的其他技術的范圍內，也許最優雅的是在輔因子的存在下使用單克隆抗體識別只存在于蛋白質的表面上抗原表位。因素IX和凝血酶原通過單克隆抗體僅與鈣含載脂蛋白的相互作用被分離（61）。洗脫引起EDTA中的存在的Ca2 +結合后又是一個只適用于輔助因子的蛋白質，在其載脂蛋白和全息形式穩定技術。采用溫度或壓力的變化，以及電泳洗脫技術進行了研究（55），但沒有發現廣泛接受。
3、技術應用
免疫吸附色譜（Immunoaffinity Chromatography, IAC）是一種常見的蛋白質分離純化手段，它所依據的原理是抗原和抗體的特異性結合，尤其是單克隆抗體（Monoclonal Antibodies, mAbs），它常用于IAC，具體的做法是，首先，將單克隆抗體通過共價鍵偶聯在親水性多孔凝膠介質上，并將偶聯了抗體的凝膠裝填在色譜柱中，然后通過加壓迫使待分離的蛋白質溶液緩慢流過色譜柱，此處的蛋白質溶液體系是有利于抗原抗體結合反應發生的體系，等到待分離的蛋白質溶液完全從色譜柱流出，開始用淋洗液淋洗，洗去非特異性結合的蛋白質成分，最后用洗脫液將被抗體固定下來的特定蛋白質洗脫下來，即可實現該種蛋白質的純化與富集。
一種蛋白質作為一種特定的抗原，它往往對應著多種抗體，不同抗體識別該抗原的不同表位，并且和該抗原的結合反應對于pH和離子強度的敏感性不一樣，如果要用IAC的方法純化該蛋白質，則需要用抗原抗體反應對pH和離子強度的敏感性高的抗體，為了找出適合用IAC方法純化?？?beta;- 乳球蛋白的抗體，本文對多種單克隆抗體和?？?beta;- 乳球蛋白之間相互作用與pH和離子強度的依賴性進行研究對比。
上圖展示的是10種抗體和pH=7時相比在pH=3~11的條件下與抗原結合的相對結合活性變化圖。
看得出來，整體上來看，過高或過低的pH條件都不利于抗原和抗體的結合，但不同抗體對于pH的敏感性和響應特性顯然不一樣。
上圖展示的是10種抗體和離子強度=0.02mol/kg時相比在離子強度=0~0.6的條件下與抗原結合的相對結合活性變化圖。
看得出來，整體上來看，過高的離子強度不利于抗原和抗體的結合，但不同抗體對于離子強度的敏感性和響應特性顯然不一樣。
上圖展示的是3種典型的抗體在和抗原結合之后被不同化學條件的洗脫液洗脫之后抗體殘留率的變化圖。
看得出來，pH降低對抗體殘留率的影響更大，而離子強度增大對于LG5.2抗體的殘留率的影響較大。
61C1抗體對于pH的敏感性最大，LG5.2抗體同時對pH和離子強度都很敏感。
一個抗原-抗體結合的反應包含多種非共價鍵的形成，比如氫鍵、靜電力、范德華力和疏水相互作用，這一結合通過表面形貌互補來實現，并且單個吸引力的多樣性促成了很高的結合能。盡管鍵合作用表明了抗體和抗原形成穩定復合物的趨勢，締合常數較低的抗體對于pH和離子強度的改變不敏感。
尤為重要的是，靜電力和疏水相互作用可能會成為一個主要因素，因為這兩種作用力對于抗原抗體結合的貢獻最大。通常情況下，隨著離子強度的增大，靜電力傾向于減小，但是疏水相互作用增加。與抗原結合的作用受離子強度影響最大的3種抗體，它們都包含6個帶電的氨基酸殘基。在這些抗原抗體結合的反應中，靜電力的作用比疏水相互作用顯著，這導致了它們對于離子強度的高度敏感。從另一方面來講，21B3抗體和抗原的結合部位有一個帶電基團和很多疏水殘基，這導致它對離子強度很不敏感。
盡管很多帶電殘基參與LG4.1、LG8.2和LG13.1抗體的抗原識別過程，但最近的研究卻證實這3種抗體可能識別的是疏水殘基，對于61B4抗體，雖然它的抗原決定簇中帶電殘基所占的比重很高，但它和抗原的結合過程為什么會對離子強度和pH不敏感，現在仍不清楚。
我們的結果也證實了高敏感性的抗體可能分子量很小，在我們研究的10種抗體里面，只有2種對于離子強度和pH是敏感的。
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